Developmental control of cold tolerance in wheat (Triticum aestivum)

مقدمه

سرما یکی از عوامل مهم ایجاد خسارت به محصولات زراعی در دنیا و ایران می‌باشد. در ایران به دلیل قرار گیری حدود 66 درصد از اراضی گندم در مناطق معتدل سرد و وقوع سرمای زودرس پاییزه، سرمای سخت زمستان و یا سرمای دیررس بهاره سالانه خسارت‌های زیادی به محصول گندم وارد می‌شود(Mahfoozi et al., 2006). از مهم‌ترین مراحل نمو گیاه، مرحله ی القای گلدهی است که این فرایند در بسیاری از گونه‌های گیاهی بر اساس پاسخ به تغییرات فصلی ناشی از محیط اطراف رخ می‌دهد. مکانیسم تحمل به سرما در گندم­ پاییزه ارتباطی اساسی  با میزان نیاز بهاره‌سازی دارد که این امر سبب تأخیر در انتقال از مرحله رویشی به زایشی شده و نتیجه آن مقاومت به سرما می‌باشد (Mahfoozi et al., 2006; Fowler et al., 1999). شکل‌گیریآغازه­های برگ تعیین کنندۀ تعداد نهایی برگ روی ساقۀ اصلی می‌باشد(Hay and Ellis, 1998) که از نیاز به بهاره‌سازی، طول روز، فیلوکرون، طول دوره رویشی و زمان گلدهی متاثر می‌شود.  گیاهانی که نیاز به بهاره‌سازی دارند چنانچه در معرض دمای پایین قرار گیرند تعداد نهایی برگ  آن­ها تا رسیدن به نقطۀ تکمیل بهاره‌سازی کاهش می­یابد و بعد از آن به تعداد ثابت خود می‌رسد(Mahfoozi et al., 2001; Fowler et al., 1996)در کروموزوم گروه پنج گندم نان با مکان­یابی صفات کمی، همولوگ­های متعدد تحمل به سرما (Fr-1) در مکان­های ژنی Fr-A1، Fr-D1 وFr-B1 به ترتیب با فواصل 2، 10 و 40 سانتی­مورگان از همولوگ ژن Vrn-1 مکان­یابی شده‌اند (Galiba et al., 1995; Toth et al., 2003). همچنین دومین ژن تحمل به سرما (Fr-A2) در کروموزوم شماره پنج گندم گزارش ­شده­است(Vagujfalvi et al., 2003). ژن Fr-A2 روی کروموزوم 5A با فاصله 30 سانتی­مورگان از ژن بهاره‌سازی Vrn-A1از پیوستگی با این ژن برخوردار است. وجود اثر پلیوتروپیک مکان ژنی بهاره‌سازی با تحمل به سرما و تیپ رشد، صرف نظر از پیوستگی ژن تحمل به سرما با مکان ژنی بهاره‌سازی Vrn-1،توسط محققین دیگری گزارش شده است(Brule-Babel and Fowler, 1998).طبق گزارش شوتکا (1981) کروموزوم­های گروه پنج گندم (5A, 5B) که حائز ژن‌های بهاره‌سازی می‌باشند نقش مهمی در بیان تحمل به سرما دارند (Shutka, 1981). پیشتر نیز گزارش شده است  که کروموزوم گروه 5A بر بیان تحمل به انجماد و نیز در بیان پروتئین‌های WSC120 نقش دارد.(Houde et al., 1992; Fowler et al., 1996) درک مکانیسم‌های تحمل به سرما در ارقام مختلف غلات می‌تواند در طراحی برنامه‌های اصلاحی و سیستم‌های تولیدی برای مناطق سرد مفید باشد. با وجود انجام برخی مطالعات در رابطه با ارتباط صفات نموی با تحمل به سرما در گندم زمستانه نورستار تحت شرایط کنترل شده(Mahfoozi et al., 2000; Fowler and Limin, 2004; Jahanbakhsh et al., 2009)اما به‌نظر می‌رسد نتایج بدست آمده شدیداً تحت تأثیر شرایط آزمایشی بوده و در مقایسه با نتایج مزرعه‌ای متفاوت باشند. زیرا در شرایط مزرعه‌ای گیاهان ممکن‌است با مجموعه‌ای از دماهای مطلوب برای سازگاری (کمتر از 10 درجه سانتی‌گراد)، دمای پایین تر از انجماد (Herman et al., 2006)  و یا دماهای نامطلوب که منجر به از بین رفتن سازگاری می‌گردد مواجه باشند. علاوه بر آن به نظر می‌رسد دماهای پایین‌تر از انجماد، شدت نور، چرخه گرم و سرد در شرایط مزرعه‌ای و تأثیر آن روی بیان برخی از ژن‌ها، افت ناگهانی دما در اطراف ریشه و کاهش هدایت هیدرولیکی ریشه‌ها در شرایط کنترل شده و سایر عوامل اکولوژیکی نظیر پوشش برف و سوزش باد در شرایط مزرعه‌ایمی‌توانند در حصول نتایج متفاوت بین مزرعه و شرایط کنترل شده تأثیرگذار باشند(Gusta et al., 2005). عادت‌دهی گندم با دماهای زیر صفر (3- درجه سانتی‌گراد) در مقایسه با عادت‌دهی با دماهای بالای صفر در شرایط کنترل شده می‌تواند تحمل به سرما را حدود 5-3 درجه بهبوددهد. با توجه به افت دما در برخی از نقاط سرد کشور در اوایل دوره رویشی به پایین‌تر از صفر درجه به نظر می‌رسد گیاهان کشت شده در این مناطق فرایند سازگاری را با دماهای زیر صفر تکمیل می‌نمایند.

تغییرات زیادی از نظر صفات مور فولوژیک، فنولوژیک (نموی) و فیزیولوژیک از قبیل انباشت پرولین، قندها، کربوهیدرات‌ها، آنزیم‌های آنتی اکسیدان‌ها.پروتئین‌های القایی مرتبط با سرما، اسیدهای امینه و دیگر متابولیت‌های محافظت کننده در دوره عادت‌دهی به سرما در غلات صورتمی‌گیرد. یکی از مکانیسم‌هایی که در مقابل تنش سرمایی عملمی‌کند، افزایش تولید پرولین آزاد است  (Matysik et al., 2002). تجمع آن در سلول باعث از بین رفتن رادیکال‌های آزاد اکسیژن، حلالیت پروتئین‌های مختلف و همچنین حفاظت آنزیم‌هااز تجزیه شدن، تنظیم اسمزی و حفظ حالت طبیعی غشاءمی‌شود. در تعدادی از گیاهان، تحت شرایط تنش تا 100 برابر شرایط نرمال غلظت پرولین افزایش می‌یابد. یکی دیگر از مهم ترین واکنشهای گیاهان در شرایط تنش، افزایش تجمع کربوهیدرات‌ها می‌باشد، کربوهیدرات‌هابا بالا بردن غلظت درون سلولی، مانع یخ زدن آن در اثر سرمامی‌شوند(Galiba et al., 1997)  و آنها از غشای پلاسمایی و پروتئین‌ها در برابر خسارت‌های تنش سرمایی محافظتمی‌کنند(Sasaki et al., 1998).

در ارتباط با نقش متابولیت‌ها، بسیاریمحققینازوجود یکهمبستگیمثبتبیننوعقندذخیره‌ای ومیزانتحملتنش‌هایغیرزیستیدرگیاهانخبرمی‌دهند،بدینمنوالکهافزایش محتوایقندبهارتقایتحملدربرابراینتنش‌هامنجرخواهدشد(Suzuki, 1989; Al-Hakimi et al., 1995) ازفرایندتجمعقندهایمحلولدرآبدربافت‌هایرویشیگیاهکهدرزمرهگروهحل شونده‌های سازگار قرارمی‌گیرندبهعنوانپاسخبسیاریازگونه‌های گیاهیدرمواجهباتنش‌هایمتنوعغیرزیستییادشدهاست. تیمارسرماافزایشقابلملاحظه‌ای درمحتوایقندمحلولدرآبسلولراسببمیشودکهاینامربابهتعادل رساندنپتانسیلآببرونسلولیهمراهاستچراکهبهتنظیمفشاراسمزیدرسلولکمکمی‌کند (Morgan, 1992).

نقش پروتیئن‌های مختلف در تحمل به سرما معنی‌دارمی‌باشد. بهره‌گیری از تجزیه پروتئومبه عنوان ابزاری سودمند در درک مکانیزم‌های تحمل به تنش‌های محیطی غیر زنده در شناسایی پروتئین‌های القا شده بر اثر تنش‌های محیطی توسط بسیاری از محققین گزارش شده است (Sarhadi et al., 2010). آنالیز پروتئومرویکردی دیگر برای کشف ژن‌هاو مسیرهای کلیدی در پاسخ به تنش‌های غیرزنده را ارایه می‌نماید. با وجودی که بررسی عکس‌العمل گیاهان در برابر تنش سرمایی در سطح DNA و RNA (ژنومیکس و ترانسکریپتومیکس) اطلاعات مهمی را در زمینه‌های فرآیندهای دفاعی فراهم آورده‌اند(Seki et al., 2001; Fowler andThomashow, 2002)، ولی مشخص شده‌است که سطوح رونوشت‌ها و پروتئین‌ها با هم همبستگی بالایی ندارند و این بدان معناست که لزوماً تمامی رونوشت‌ها به پروتئین ترجمه نمی‌شوند و برخی از آنها پیش از رسیدن به ریبوزوم تجزیهمی‌شوند. به علاوه بسیاری از پروتئین‌ها از طریق تغییرات پس از ترجمه نظیر فسفریلاسیون، گلیکوزیله شدن،یوبی‌کویتینهشدنو سایر موارد دچار تغییر و تحول می‌شوند. شناخت تمام پروتئین‌های بیان شده (پروتئوم) در یک بافت یا اندام در یک دوره زمانی جهت درک بیولوژی سلولی یا اندام ضروری می‌باشد. پروتئوم وضعیت واقعی سلول یا اندام را منعکس‌ می‌نماید و در واقع بعنوان پل ارتباطی مابین ترنسکریپتوم و متابولوم می‌باشد. پروتئین‌ها بصورت مستقیم در فرآیند‌های بیوشیمیایی وارد عمل می‌شوند و از این رو مطالعه آنها در مقایسه با نشانگرهای DNA به کارکردسلولی و خصوصیات فنوتیپی نزدیکتر می‌باشند.

به منظور بررسی ارتباط بین صفات نموی، صفات فیزیولوژیک، انباشت متابولیت‌های بیوشیمیایی، بیان ژن‌هایبهاره‌سازی و پروتئین‌های سرما القاییارقام زمستانه، بینابین و بهاره در حین دوره‌های عادت‌دهی، قبل و بعد از تکمیل بهاره‌سازی و  اوایل دوره زایشی گیاه آزمایشاتمختلفی تحت شرایط مزرعه‌ای در مناطقسرد زنجان و معتدل کرجو نیز شرایط کنترل شده صورت گرفت کهنتایج آن که به شرح زیر است.

الف- ارتباط نیاز بهاره‌سازی با تحمل به سرما و تجزیه پروتئوم برگ گندم سازگار شده به سرما در دمای پایین در شرایط کنترل شده:  به منظور بررسی سازوکار نموی و تحمل به تنش سرما در گندم، در تحقیقی تغییر الگوی بیان پروتئین‌ها، تعیین روابط بین بهاره‌سازی و ژن‌های القاء شده تحت تاثیر دمای پایین ولی بالای صفر درجه سانتیگراد دمای 2 درجه سانتی­گراد) با استفاده از پروتئومیکس در ارقام متحمل نورستار و نیمه متحمل آذر2 انجام پذیرفت. ارقام مورد مطالعه در دمای 2 درجه سانتی­گراد در طول یک دوره 89 روزه به سرما سازگار شدند و تحمل به سرما با استفاده از روش LT₅₀(دمایی که در آن 50% بوته­ها بر اثر آن دما از بین می­روند) اندازه‌گیری شد. همچنین تکمیل دوره بهاره‌سازی با شمارش تعداد برگ‌های انتهایی در فاصله بین دوره سازگاری به سرما تخمین زده شد. ارقام نورستار و آذر2 تحت تاثیر دمای پایین، کاهش قابل توجه تعداد برگ‌های انتهایی را در پاسخ به بهاره‌سازی نشان دادند. میزان LT₅₀ رقم آذر2 با تیپ رشد بینابین پس از 28 روز تکمیل بهاره‌سازی حدود 8- درجه سانتی­گراد شد. در صورتی که در رقم زمستانه نورستار با نیاز بهاره‌سازی طولانی حداکثر تحمل به سرما در زمان تکمیل بهاره‌سازی(بین روز 42-35) به 7/18- درجه سانتی­گراد،35 روز دوره بهاره‌سازی وارد فاز زایشی می­گردد).حداکثر بیان تحمل به سرما در زمان تکمیل بهاره‌سازی بوده و بعد از آن میزان بیان تحمل به سرما کاهش می­یابد. در هر دو رقم متحمل و نیمه متحمل بعد از اعمال تیمار دوره­های متفاوت عادت‌دهی به سرما تعدادی از پروتئین‌ها افزایش بیان و تعدادی نیز کاهش بیان نشان دادند. پروتئین‌های شناسایی شده به پروتئین‌های تنظیم کننده سرما، پروتئین‌های ضدیخ، پاسخ­های دفاعی تنش اکسیداتیو، تثبیت کربن، تنظیم کننده‌های پس از رونویسی، پروتئین‌های کلروپلاستی، متابولیسمی و سنتزی گروه بندی شدند.

پروتئین‌های پاسخ دهنده به تنش سرما در شرایط کنترل شده:

شواهد قوی وجود دارد که نشان می­دهد ژن Cor/Leaمی‌تواند در تحمل به یخ ­زدگی کمک کنند. در تحقیق ما تعداد 15 پروتئین COR/LEA شناسایی گردیدند که شامل پروتئین‌های سازگار به سرما WCS19،WCOR719، پروتئین COR وابسته به LEA/RABپروتئین‌های­ پاسخ دهنده به سرما (لکه 125، 139 و141)، پروتئین‌های تنظیم کننده سرما،پروتئین‌هایسازگاربهسرماWCOR615،WCOR14cپروتئین پاسخ دهنده به تنش سرما و WCOR14a می­باشند. نتایج مشاهدات نشان داد که سطح بیان پروتئین COR/LEA در بالاترین سطح تحمل به دمای پایین در رقم نورستار بیان شده ولی سطح بیان آن در رقم آذر2 پایین بود. WCS19 در رقم نورستار و آذر2 تحت شرایط تنش افزایش بیان نشان دادند در رقم نورستار لکه پروتئینی شماره 111 هیچ گونه تغییری را نشان نداد اما در رقم آذر2 در هر چهار دوره عادت‌دهی به سرما نسبت به تیمار شاهد (20C°) تغییرات معنی‌دار مشاهده شد. لکه پروتئینی شماره 112 در رقم متحمل نورستار در 42 و 56 روز عادت‌دهی به سرما نسبت به تیمار شاهد بیان­شان تغییر کرده بود در حالی که در رقم نیمه متحمل آذر2 در تمامی مراحل نمونه‌برداری نسبت به تیمار شاهد تغییرات معنی‌دار بود. بیان پروتئین‌های مرتبط با تحمل به سرما مانندWcor18 (126) اگر چه در دو ژنوتیپ بسیار متحمل و نیمه متحمل بیان شدند ولی سطح بیان و مدت زمان بیان در رقم نورستار بیشتر بود. نتایج این تحقیق ثابت کرد تنش سرما باعث القاء بیان CBF‌ها
(C-repeat binding factor) یا همان DREB1ها(Dehydration-responsive element-binding  protein) می­شود که این عامل می‌تواند به سیس المنت ژن‌هایCorمتصلگردیدهو بیان آن­ها را القاء نماید و نهایتا فعال شدن این ژن‌ها منجر به افزایش تحمل به سرما می­گردد. همچنین ژن‌هایCbfمشابهبا این فاکتور در گندم نان به عنوان فاکتورهای رونویسیژن‌هایCor/Lea دخیل در ایجاد مقاومت به سرما در این گیاه عمل می‌کنند. ژنوتیپ­های با تیپ رشدی زمستانه (آلل vrn-1)، سطوح پایین­تری از رونوشت VRN-1و میزان بالاتری از بیان ژن‌هایCbf خاص را تا زمان انجام بهاره‌سازی نشان می‌دهند. ژنوتیپ­های زمستانه که آلل vrn-1 را حمل می‌کنند پس از بهاره شدن نسبت به زمان قبل از بهاره‌سازی سطوح پایین­تری از رونوشت Cbf را نشان دادند(Sarhadi et al., 2010). تحقیق حاضر افزایش بیان تعداد زیادی از ژن‌هایCor/Lea را در ژنوتیپ متحمل نورستار نشان داد که احتمالا تحت تاثیر تکمیل بهاره‌سازی است. انتظار می­رود که چندین ژن Cbf و Corدر پاسخ به سطوح بالایVRN-1 بعد از تکمیل بهاره‌سازی کاهش بیان پیدا کنند. به هر حال کاهش معنی‌داری در تجمع پروتئین‌هایCOR/LEA در روز 56 از دوره عادت‌دهی به سرما مشاهده نشد. عدم مشاهده تفاوت معنی‌دار در روز 56 ممکن است به علت تاخیر زمان بین تکمیل بهاره‌سازی (زمانی که میزان پروتئین VRN-1 افزایش یافته) و اثر کامل این افزایش بر کاهش بیان پروتئین‌هایCOR/LEA باشد. علاوه بر این پیشنهاد شده که مکانیسم فعال شده در اثر VRN-1 ممکن است در تنظیم بیان ژن‌های خاصی که در پاسخ به سرما فعال شده‌اند دخالت داشته باشند و از طرف دیگر حضور رونوشت VRN-1 برای کاهش بیان ژن‌هایCor لازم است اما کافی نیست (Dillon et al., 2010).

همچنین 3 پروتئین دیگر متعلق به گروه پروتئین‌هایLEAشناسایی شدند که شامل ‌Wcor14aو لکه­های پروتئینی 848، 849 و850 بودند که تنها در رقم متحمل نورستار مشاهده شدند. پروتئین Wcor14a پروتئین هدف کلروپلاستی است که تحت شرایط دمای پایین و روشنایی بیان می­شود (Takumi et al., 2003; Crosatti et al., 1995). در تحقیق ما همچنین مشاهده شد که در گروه پروتئینیWCOR، انباشت اکثر لکه­های پروتئینی القاء شده بر اثر تنش سرما در مرحله رویشی صورت گرفته و مدتی قبل از تکمیل دوره بهاره‌سازی به حداکثر رسیده ولی بعد از تکمیل بهاره‌سازی در هر دو رقم نوستار و آذر2 کاهش معنی‌دار در بیان پروتئین‌ها مشاهده شد. کاهش بیان اکثر پروتئین‌ها در رقم آذر2، زودتر از رقم نورستار صورت گرفت، هر چند برخی لکه­های پروتئینی نیز تظاهر یافتند که بیان آن­ها از قاعده بالا پیروی نکردند. نتایج به دست آمده نظریه کنترل نموی (Developmental Regulation) و کاهش مقاومت پس از انتقال از مرحله رویشی به زایشی، پیشنهادی محفوظی و همکاران 2001 و 2000، فولر و همکاران 2001 و 1999 را تایید می­نماید. طبق نظریه کنترل نموی تحمل به سرما، ژن‌های نموی نظیر ژن‌های فتوپریود، بهاره‌سازی و افزایش تعداد برگ، طول مدت بیان ژن‌های ساختمانی را تنظیم می‌نمایند. در مکان یابیژن‌های مرتبط با مقاومت به سرما اثرات پلیوتروپیک بهاره‌سازی روی نمو و بیان ژن‌های مقاومت به سرما گزارش شد.

پروتئین‌های ضدیخ حفاظت کننده در برابر یخ ­زدگی در شرایط کنترل شده:

پروتئین‌های ضدیخ گیاهی همولوگ(Pathogenesis-related)PRپروتئین‌ها هستند و شاملβ -1و3 گلوکاناز، کیتینازها، پروتئین‌های شبه تائوماتین و پروتئین‌های بازدارنده پلی گالاکتوریناز می­باشند(Sarhadi et al., 2010).

پروتئین PR-4 تنها در رقم متحمل نورستار شناسایی شد و β -1و3 گلوکاناز در هر دو ژنوتیپ تنها در دوره سازگاری به سرما مشاهده شد. بیان پروتئین شبه تائوماتین در رقم نورستار در طول دوره سازگاری به سرما در محدوده تکمیل بهاره‌سازی (42 و 56 روز)  مشاهده شد. اما هیچ تغییری در بیان این پروتئین در رقم آذر2 دیده نشد. یکی از β -1و3 گلوکاناز­ها تنها در رقم متحمل نورستار در 28، 42 و 56 روز عادت‌دهی به سرما مشاهده شد. کیتیناز نیز در28،42 و 56 روز تیمار عادت‌دهی نسبت به سرما تغییرات معنی‌داری رانسبت به شاهد نشان داد اما در رقم آذر2 هیچ گونه تغییری مشاهده نشد. شواهد علمی نشان داده­اند که در گیاهان، بتا 1و3 گلوکاناز­ها در چندین فرایند فیزیولوژیکی شامل پاسخ به تنش‌های غیر زنده دخالت دارند  (Torabi et al., 2009; Yaish et al., 2006).پروتئین‌هایPR در پاسخ به حمله پاتوژن‌ها، تنش‌های محیطی، ترکیبات شیمیایی و زخم شدگی در گیاهان بیان می­شوند (Van Loon et al., 1997). 

پروتئین‌های مرتبط با تنش اکسیداتیو:

اکثر تنش‌های محیطی از جمله سرما، با افزایش گونه‌های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species) در درون سلول و بروز واکنش­های اکسیداتیو موجب اثرات سوء بر سلول و متابولیسمسلولیمی­شوند(Torabiet al.,2009). پروتئین‌های دخیل در تنش اکسیداتیو گزارش شده‌اند. همه 3 پروتئین SOD (Superoxide dismutase) شناسایی شده در رقم نورستار افزایش بیان داشتند در صورتی که در آذر2, مقدارCu/Zn superoxide dismutase کاهش بیان داشت و بیان Mg superoxide dismutase  هیچ تغییر معنی‌داری را نشان نداد وCu/Zn superoxide dismutase  نیز تنها در تیمار 56 روز عادت‌دهی به سرما افزایش بیان داشت.آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مانند سوپراکسیداز دیسموتاز از مهم‌ترین آنزیم­ها در برابر حذف اکسیژن فعال مولکولی (ROS; Reactive Oxygen Species) می­باشند که در تبدیل رادیکال­های سوپر اکسید به اکسیژن مولکولی دخالت دارند و سوپر اکسید را به مولکول­های پراکسید هیدروژن که سمیت کمتری دارند تبدیل می‌کنند، این آنزیم­ها در انواع تنش‌های غیر زنده گزارش شده‌اند(Gazanchian et al., 2007). در تحقیق حاضر بیان پراکسی ردوکسین (لکه پروتئینی 177) در طول دوره سازگاری به سرما تنها در رقم آذر2 در تیمارهایسرما دهی 28،42 و 56 روز نسبت به تیمار شاهد معنی‌دار بود در حالی که در رقم نورستار با بهاره‌سازی طولانی (لکه پروتئینی 486) در تمامی مراحل نمونه‌برداری نسبت به شاهد افزایش بیان داشت ولی هیچ تغییری در رقم آذر2 با بهاره‌سازی متوسط دیده نشد. از دیگر پروتئین‌های دخیل در دفاع اکسیداتیو که در این تحقیق شناسایی شد گلوتاتیون ترانسفراز (508) وS-like RNase (482) بود که در رقم نورستار افزایش بیان داشت ولی در رقم آذر2 تغییری برای این پروتئین دیده نشد. گلوتاتیون ترانسفرازها از آنزیم­های درگیر در مسیرهای مختلف متابولیسم گیاهان می­باشند که در سیتوسول­ها به وفور یافت می­شوند و در هدایت بسیاری از واکنش­های مهم سلولی نقش دارند. یکیاز اعمال مهم گلوتاتیون ترانسفراز سم زدایی ترکیبات سمی حاصل از اکسیژن فعال است که نقش مهمی در کاهش اثرات تنش اکسیداتیو و افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنش‌های محیطی ایفا می­نماید(Galle et al., 2005).

پروتئین‌های درگیر در فتوسنتز و متابولیسم کربن:

کلروپلاست به عنوان مهم‌ترین و اصلی­ترین اندام فتوسنتزی گیاه، یکی از محل­های عمده تولید ROSها به هنگام تنش هستند. از اینرو، سرما با تاثیر بر ساختار کلروپلاست­ و کاهش و یااز بین بردن رنگیزه­های گیاهی از جمله کلروفیل و نیز غیرفعال نمودن تعدادی از آنزیم­های مهم شرکت­کننده در فرایـند فتوسنتز، دارای اثرات نامطلوب بر این فرایند مهـم حیاتی می­باشد. نتایج حاصل از تحقیق ما نشان می­دهد اعمال تنش سرما با تأثیر بر افزایش بیان تعدادی از پروتئین‌ها و آنزیم­های شرکت­کننده در ساختار کلروپلاست  و واکنش­های نوری و نیز آنزیم­های مهم چرخه کالوین نقش مهمی در حفظ فرایند فتوسنتز و در نتیجه بقاء گیاه در شرایط تنش سرما بر عهده دارد.

پروتئین‌های شناسایی شده به 3 زیر گروه تقسیم بندی شدند که گروه 1 پروتئین‌هایی هستند که در واکنش­های مرحله نوری فتوسنتز دخیل می­باشند. پروتئین‌های گروه دوم مربوط به چرخه کالوین می­باشد و گروه سوم پروتئین‌های تنظیم کننده دستگاه فتوسنتزی است. لکه­های پروتئینی با عنوان پروتئینOxygen – evolving enhancer protein1 ،پروتئین‌های با عنوان Oxygen – evolving enhancer protein2 و پلاستوسیانین  پروتئین‌های گروه 1 می­باشند که در پایداری فتوسیستم II نقش دارند و جزئی از کمپلکس فتوسیستم II می­باشند. فتوسیستم II  به عنوان یکی از مراکز واکنش نوری فتوسنتز در غشای تیلاکوئید قرار دارد که در فرایند اکسیداسیون آب و آزاد سازی پروتون در چرخه انتقال الکترون و پروتون فرایند فتوسنتز نقش دارد. در تحقیق ما پروتئین‌های مربوط به گروه 1 به جزء پلاستوسیانین در رقم متحمل نورستار افزایش بیان داشتند در حالی که در رقم آذر2 پلاستوسیانین تغییرات  معنی‌داری را نسبت به شاهد نشان دادند.

از جمله پروتئین‌های دیگری که در پاسخ به تنش سرما تغییرات معنی‌داری را نشان دادند زیر واحدهای کوچک آنزیم روبیسکو می­باشند. نتایج ما نشان می­دهد که تنش سرما تجزیه اجزا یا به عبارتی دستگاه فتوسنتز را در رقم آذر2 که نسبت به رقم نورستار حساس­تر می­باشدُ تشدید کرده است. در تحقیقات مختلفی از بین رفتن جزئی فتوسنتز در تنش‌های غیر زنده مانند تنش سرما و تحت تنش‌های خشکی گزارش شده است. نتایج تحقیقات حاضر اشاره دارد که تغییرات در بیان پروتئین‌های فتوسنتزی در طی سازگاری به سرما اتفاق می­افتد اما مطالعات بیشتری برای درک تغییرات بالا در سازگاری به سرما در گندم لازم است.تیوردوکسین­ها (Trx) هم یکی از آنزیم­های بسیار مهم شرکت­کننده در اکثر فرایندهای متابولیک سلول­هامی­باشند( (Balmer et al., 2004. تیوردوکسین­ها در تعدادی از فرایندهای بیوشیمیایی مانند نقل و انتقال پروتئین و نشاسته در زمان جوانه­زنی بذور غلاتو تنظیم فعالیت آنزیم­های درگیر در متابولیـسم کربوهیدرات‌هانیز دخالت دارند(Balmer et al., 2004).همچنین این آنزیم­ها از آنزیم­های مهم در مسیرهای متابولیک و تنظیمی دیگر همچون چرخه کالوین، متابولیسم انرژی، فتوسنتز، پیچش پروتئین‌ها و سنتز آمینواسیدها محسوب می­گردند.علاوهبراین،خاصیتآنتی‌اکسیدانی،تیوردوکسین‌ها باعث محافظت سلول­ها در برابر تنش‌های اکسیداتیو حاصل ازتنش‌هامی­شودوازطریقحذفH₂O₂وبرخیرادیکال‌های آزاد،در فرایند سم­زداییاین ترکیبات شرکت می­نمایند.

از نتایج حاصل از تحقیق حاضر، به نظر می­رسد که رقم نورستار متحمل به سرما از نظر کمی، تعداد بیشتری از پروتئین‌های القاء شده بر اثر سرما را به مدت طولانی­تر در مقایسه با رقم نیمه متحمل آذر2 بیانمی‌کند. در تحقیق حاضر ارتباط نزدیکی بین بیان تحمل به سرما و زمان تکمیل بهاره‌سازی در ارقام متحمل و نیمه متحمل و کاهش میزان تحمل، بعد از تکمیل بهاره‌سازی مشاهده شد. نقش صفات نموی نظیر بهاره‌سازی و تاثیر آن در بیان تحمل به سرما در گزارشات علمی قبلا نشان داده شده است(Mahfoozi et al., 2000; Limin and Fowler, 2006).ولی تحقیق حاضر این ارتباط را بسیار دقیق­تر و در سطح پروتئین (پروتئوم) به خوبی نشان می­دهد. نتایج بررسی ما در شرایط کنترل شده نشان داد اگرچه در تعداد و الگوی بیان ژن‌های القاء شده در دمای پایین در دو ژنوتیپ اختلاف وجود دارد ولی به نظر می­رسد تنظیم کننده­های عمومی، کنترل بیان این ژن‌ها را در هر دو ژنوتیپ بر عهده دارند.

ب – انتقال از مرحله رویشی به زایشی و تجزیه پروتئوم برگ ارقام گندم بهاره و پاییزه سازگار شده به سرما در دماهای زیر صفر درجه سانتیگراد در شرایط مزرعه:

به منظور بررسی ارتباط بین صفات نموی، صفات فیزیولوژیک و تحمل به سرمای رقم زمستانه و متحمل (نورستار) و رقم بهاره و حساس (پیشتاز) در حین دوره عادت‌دهی، قبل و بعد از تکمیل بهاره‌سازی و  اوایل دوره زایشی گیاه آزمایشی تحت شرایط مزرعه‌ای در منطقه سرد زنجان صورت گرفت. بررسی روند تحمل به سرما در تاریخ‌های نمونه‌برداری حاکی از آن بود که با افزایش دوره عادت‌دهی به سرما در شرایط مزرعه میزان تحمل به سرما افزایش می‌یابد به طوری که این روند افزایشی تا 30 آذر ماه ادامه داشت. شیب و روند تحمل به سرما به گونه‌ای بود که گندم زمستانه نورستار و بهاره به طور معنی‌داری متفاوت بود. در اولین تاریخ نمونه‌برداری رقم زمستانه نورستار در توانست تحمل به سرما خود را تا  ºC 4- افزایش دهند در حالیکه تحمل به سرما در رقم بهاره در مقایسه با شاهد (بدون عادت‌دهی) تغییر معنی‌داری نداشت. چنین تفاوتی در تحمل به سرما در بین ارقام را می‌توان به پایین بودن آستانه دمایی برای تحریک شروع فرایند عادت‌دهی و تفاوت در سرعت آغازین عادت‌دهی به سرما  در ارقام زمستانه  و تأمین دماهای مطلوب برای شروع این فرایند در منطقه زنجان نسبت داد. پیش‌تر فولر (2008) دریافت که ارقام مقاوم گندم در مقایسه با ارقام حساس به سرما قادرند فرایند عادت‌دهی خود را با دماهای بالاتر آغاز نمایند و دامنه دمایی تحریک کننده سازگاری به سرما در آنها گسترده‌تر می‌باشد.

بررسی اثر متقابل ژنوتیپ و محیط:

تغییرات نموی: ارتباط تغییرات نموی با روند تحمل به سرما در ارقام گندمMV17 و شهریاردرمنطقه معتدل سرد (کرج) و منطقه سرد (زنجان) در سال زراعی 89-88  بررسی شدند. بیشترین کاهش در تعداد نهایی برگ رقمMV17  بعد از 79 روز پس از کاشت (8 دی ماه) در زنجان مشاهده گردید، روندنسبتامشابهیدرکرجمشاهدهشد.ادامهنمونه‌برداری‌های در زمان‌های بعدی حاکی از ثبات تعداد نهایی برگ در هر دو منطقه بود که این بدان نکته اشاره دارد که احتمالاً مابین 79  تا 100 روز پس از کاشت (8 دی تا 4 بهمن) زمان تکمیل نیاز بهاره‌سازی می‌باشد. تکمیل  بهاره‌سازی رقم شهریار  زودتر از رقم MV17  و در هر دو منطقه حدود 58  روز پس از کاشت (21 آذر ماه)  بود،  ولی تعداد کاهش برگ  نیز در اقلیم سرد  زنجان بیشتر از اقلیم معتدل سرد کرج بود..

تغییرات نموی ارقام MV17 و شهریار در سال 1388 نشان داد که نمو فنولوژیکی ارقام تحت تاثیر شرایط اقلیمی سرد  و یا معتدل سرد قرار گرفت. هر دورقم MV17 و شهریار پس از 75 روز پس از کاشت به ترتیب با تولید 3/4 و 3/5 برگ در روی ساقه اصلی در مرحله فیزیکی رشد رویشی بودند. در 23 دی ماه (90 روز پس از کاشت) در زنجان، ارقام MV17  و شهریار به ترتیب در مرحله 5 و 6 برگی ولی در کرج رقم MV17 در مرحله 6 برگی و رقم شهریار با 5/6 برگ در شروع مرحله برجستگی دو گانه قرار داشت. حدود 101 روز پس از کاشت در زنجان ارقام MV17 و شهریار با تولید به ترتیب 5/5 و 5/6 برگ درانتهای مرحله رویشی ولی در کرج رقمMV17  با تعداد 3/6 برگ روی ساقه اصلی در مرحله طویل شدن مریستم  انتهایی  و رقم شهریار با 3/7 برگ در مرحله تشکیل برجستگی دو گانه بود. در 4 اسفند ماه (131 روز پس از کاشت) در زنجان، رقم MV17 با 6 برگ در مرحله شروع برجستگی دوگانه و در کرج در مرحله تکمیل برجستگی دو گانه بود. در همان زمان رقم شهریار در زنجان با 5/7 برگ در مرحله برجستگی دو گانه و در کرج در مرحله تشکیل آغازین گلوم بود. در نمونه­های 4 اسفند ماه که مدت ده روز در گلخانه نگهداری شده بودند رقم MV17 از زنجان و کرج به ترتیب در مرحله برجستگی دو گانه و تشکیل سنبلچه انتهایی ولی رقم شهریار جمع آوری شده از زنجان و کرج به ترتیب در مراحل آغازین گلوم- لما و در مرحله پیشرفته نمو مریستم انتهایی قرار داشتند. تشکیل برجستگی­های دوگانه یکی از روش‌های تعیین مراحل نمو و انتقال به مرحله زایشی ارقام مختلف غلات است چرا که در این مرحله با وجودی­که ظاهرا گیاه درمرحله رویشی می‌باشد ولی پیام­های مورد نیاز برای شروع رشد زایشی دریافت شده‌اند(Danyluk et al., 2003). تغییر مراحل نموی ارقام در شرایط اقلیم معتدل سرد بیشتر از اقلیم سرد بود. در عوض دمای پایین در اقلیم سرد باعث تاخیر در انتقال از مرحله رویشی به زایشی و تاخیر در نمو شد  و این تاخیر به نظر می­رسد باعث شد که تحمل رقم پاییزه در اقلیم سرد افزایش یابد.

روند تحمل به سرما:

رقم پاییزه MV17 بعد از قرارگرفتن در دمای سرد شروع به عادت به سرما کرد. منحنی روند تحمل به سرما ابتدا با شیبی تند شروع و سپس این شیب کندتر شد تا اینکه در تقریبا در محدوده تکمیل بهاره‌سازی به حداکثر مقدار خود رسید. حداکثر تحمل ارقام MV17 و شهریار در زنجان به ترتیب LT₅₀= -19^oC و LT₅₀= -16^oC و در کرج حداکثر میزان تحمل به ترتیب LT₅₀= -12^oC و LT₅₀= -8^oC بودند. دمای پایین در زنجان باعث تاخیر در چرخه نموی ارقام در زنجان شد و مدت زمان بیان و میزان تحمل به سرما درهر دو رقم در اقلیم سرد، بیشتر از تحمل ارقام رشد یافته در اقلیم معتدل سرد بود که بیانگر اثر متقابل دما و نمو گیاه بر تحمل به سرما می‌باشد. ارقام گندم مورد بررسی، حداکثر تحمل خود را در شرایط مزرعه در زمان تکمیل بهاره‌سازی بدست آوردند. از این نتایج چنین استنباط می­شود محیطی که گیاه در آن عادت‌دهی به سرما می‌کند و صفات نموی نظیر نیاز بهاره‌سازی و تغییرات فنولوژیکی بر میزان و روند تحمل به سرما تاثیر دارند.

ت- آنالیز متابولیت‌های مرتبط با تحمل به سرما در ژنوتیپ‌های دارای صفات نموی متفاوت

در این پژوهش ابتدا پاسخ تیمارهای خوگیری به سرما با طول دوره­های متفاوت سرمادهی در ارقام گندم نان که واجد نیازهای متفاوت بهاره‌سازی (از زمستانه تا بهاره) بودند در مزرعه و نیز شرایط محیط تحت کنترل در دوره­های متفاوت سرمادهی، مورد بررسی قرار گرفت تا در راستای تحمل به سرما، به تشخیص رابطه نیاز بهاره‌سازی با روند نمو گیاه، تجمع برخی ترکیبات بیوشیمیایی محافظ گیاه در برابر سرما و ارزیابی برخی ویژگی­های فیزیولوژیک مرتبط با این فرایند پرداخته شود.

روند تغییرات محتوای قند:

توان خوگیری ارقام مورد ارزیابی طی دوره سرمادهی و آنگاه روند تحلیل رفتن این توانایی، با مراحل نموی گیاهان از همبستگی قابل ملاحظه­ای برخوردار بود، به­طوری­که دماهای پایین موجب ارتقای مقاومت به سرما در ارقام بینابین و زمستانه گردید. تغییرات قند در مزرعه در ارقام زمستانه و بینابین محتوای قند کل در هر دو بافت برگ و طوقه طی فصل پاییز رو به افزایش نهاد به طوری که بیشترین میزان ثبت شده در ارقام الوند و شهریار برای هر یک از بافت‌های طوقه و  برگ در اواخر پاییز و اوایل زمستان رقم خورد، اما این روند  تزایدی  برای  رقم  زمستانه نورستار تا نیمه زمستان در خصوص بافت طوقه تداوم یافت. در رقم بهاره کویر، تغییریمعنی‌دار در محتوای قند طوقه ملاحظه نگردید اما در بافت برگ، روند تغییر تا اواخر پاییز و اوایل زمستان افزایشی بود و پس ازآن تنزل یافت. در شرایط محیط کنترل شده، روند تغییرات محتوای قند در هر دو بافت مشابه بود. با افزایش مدت­زمان استقرار در اتاق سرد، محتوای قند طوقه در همه ارقام افزایش یافت، در رقم بهاره کویر بیشترین سطوح تجمع قند پس از 14 روز استقرار در اتاق رشد سرد و برای دیگر ارقام این وضعیت پس از 21 روز اتفاق افتاد. بیشترین سطوح میزان قند در بافت برگ پس از استقرار به مدت  14، 21، 28 و  28 روز استقرار در اتاق سرد، به­ترتیب در ارقام کویر، الوند، شهریار و نورستار ثبت گردید.

تغییرات در محتوای قند همسو با روند تحمل به سرما در شرایط مزرعه بود. در رقم بهاره کویر میزان گلوکز طی فصل پاییز تغییری نیافت اما بتدریج در فصل زمستان رو به افزایش نهاد. میزان فروکتوز در طول فصل پاییز از روندی مشابه با گلوکز تبعیت نمود. اما در فصل پاییز با تغییراتی مواجه بود. تجمع ساکارز در فصل پاییز رو به کاستی نهاد اما به میزان قابل ملاحظه­ای در فصل زمستان بر سطوح آن افزوده شد. میزان فروکتان در طول پاییز تغییر چندانی نیافت اما با پیشرفت فصل زمستان در حد معنی‌داری از میزان آن کاسته شد. در رقم الوند با نیاز کوتاه­مدت بهاره‌سازی محتوای گلوکز در فصل پاییز تغییری نیافت، به­طوری­که این ثبات وضعیت تا نیمه­های زمستان نیز تداوم یافت اما پس از آن با روندی افزایشی مواجه شد. محتوای فروکتوز در حد معنی‌داری در فصل پاییز افزایش یافت آنگاه با شروع زمستان به تدریج کاهش یافت و این کاهش به صورتیمعنی‌دار در نیمه زمستان تظاهر یافت. محتوای ساکارز در فصل پاییز از تغییری قابل ملاحظه برخوردار نبود اما در طول زمستان به تدریج روندی افزایشی را دنبال کرد. فروکتان نیز طی پاییز به میزانیمعنی‌دار افزایش یافت ولی در زمستان به­تدریج با روندی کاهشی روبرو شد.

در رقم شهریار با نیاز بهاره‌سازی متوسط از سطوح گلوکز در پاییز کاسته شد اما در زمستان رو به فزونی نهاد، محتوای فروکتوز در پاییز افزایش یافت که این روند افزایشی تا نیمه زمستان تداوم یافته وسپس رو به افول نهاد. تغییر محتوای ساکارز در پاییز چندان معنی‌دار نبود اما در زمستان افزایش یافت و محتوای قند فروکتان طی پاییز تا نیمه زمستان از روندی افزایشی برخوردار بود و آنگاه رو به کاهش نهاد. در رقم نورستار محتوای گلوکز در پاییز با روندی رو به نقصان و معنی‌دار توأم بود، این کاهش تا نیمه زمستان تداوم یافت آنگاه شروع به رشد نمود. تغییرات محتوای فروکتوز طی پاییز تا نیمه زمستان از روندی افزایشی برخوردار بود سپس با کاهشی ناگهانی مواجه گشت. محتوای ساکارز در طول پاییز تغییر معنی‌داری نداشت اما با شروع زمستان افزایش یافت که این روند افزایشی تا نیمه­های زمستان تداوم یافت، درخصوص فروکتان مقدار آن در طول پاییز به­سرعت افزایش یافت که این روند سریع افزایشی تا نیمه­های زمستان ادامه یافت سپس نزول مقادیر آن آغاز گردید.

در شرایط کنترل­شده با توسعه دوره استقرار بوته­های رقم بهاره کویر در اتاق سرد میزان گلوکز با روندی کاهشی مواجه گردید، سطوح فروکتوز ابتدا با کاهش مواجه شد سپس بدون تغییر باقی­ ماند، میزان ساکارز از روندی نزولی مشابه با گلوکز پیروی کرد و محتوای فروکتان تا 14 روز استقرار در اتاق سرد از رشدی نسبی برخوردار بود و آنگاه تا پایان دوره نسبتاً بدون تغییر ماند. در رقم بینابین الوند با تداوم دوره سرمادهی میزان گلوکز تا 14 روز استقرار در اتاق سرد (1±3 درجه سانتی‌گراد) کاهش یافت سپس بدون تغییر باقی ماند، سطوح فروکتوز نیز طی دو هفته نخست استقرار در اتاق سرد از روندی کاهشی برخوردار بود و آنگاه با افزایشی جزئی مواجه گردید و در ادامه بدون تغییر باقی ماند. محتوی ساکارز نیز طی دو هفته نخست از روندی کاهشی برخوردار بود و سپس بدون تغییر ماند. روند افزایش در میزان فروکتان تا سه هفته تیمار سرمادهی تداوم یافت و پس از آن بدون تغییر باقی ماند. در رقم شهریار طی دو هفته نخست استقرار در اتاق سرد محتوای گلوکز کاهش یافت آنگاه بدون تغییری معنی‌دار نسبتاً ثابت ماند. از میزان فروکتوز طی دو هفته نخست استقرار در اتاق سرد کاسته شد تا هفته سوم تقریباً ثابت ماند، آن­گاه مجدداً روند کاهشی آن آغاز گردید. محتوای ساکارز نیز طی دو هفته نخست دچار کاهش شد آنگاه با اندکی افزایش مواجه شد و پس از آن نسبتاً بدون تغییر باقی ماند. محتوای فروکتان طی چهار هفته نخست استقرار بوته­ها در اتاق سرد به میزان قابل ملاحظه­ای افزایش یافت. در رقم نورستار میزان گلوکز طی دو هفته نخست نقصان یافت سپس تا هفته سوم با افزایشی ناچیز مواجه گردید و آن­گاه ثابت ماند. کاهشی ناگهانی در سطوح فروکتوز طی دو هفته نخست استقرار در اتاق سرد مشاهده شد، متعاقب آن کاهشی جزئی در آن به وقوع پیوست و سپس بدون تغییر باقی ماند. میزان ساکارز در دو هفته آغازین اعمال تیمار سرما به سرعت کاهش یافت آنگاه تا هفته سوم با افزایش مواجه بود و پس از آن بدون تغییر ماند. محتوای قند فروکتان از روندی تزایدی برخوردار بود که این روند از هفته سوم به بعد از شتابی چشمگیر برخوردار گشت. 

روند تحمل به سرما:

در مزرعه تغییرات حاصل در میزان تحمل رقم بهاره کویر چندان قابل ملاحظه نبود، به­طوری­که شاخص LT₅₀ در این رقم طی پاییز رو به تنزل تدریجی اما نه چندان معنی‌دار نهاد، آن­گاه پس از افزایشی جزئی، این شاخص طی نیمه دوم پاییز تا اواخر زمستان تقریباً ثابت ماند. در رقم بینابین الوند و نیز در ارقام زمستانه شهریار (با نیاز بهره سازی متوسط) و نورستار (با نیاز بهاره‌سازی طولانی) این شاخص در پاییز رو به افول نهاد که به مثابه افزایش میزان تحمل می‌باشد، به­نحوی­که در انتهای پاییز به کمترین مقدار خود رسید اما در طول زمستان با روندی تدریجی رو به فزونی نهاد، در مجموع پایین­ترین حد شاخص LT₅₀ در ارقام نورستار، شهریار، الوند و کویر به ترتیب 7/18-، 3/9-، 7/6- و 7/3- درجه سانتیگراد به ترتیب بین 23-16 دسامبر، 16-5 دسامبر و 16-5 دسامبر به ثبت رسید که تقریباً مصادف با محدوده­های تکمیل بهاره‌سازی این ارقام بود. در محیط کنترل شده نیز نتایج مشابهی به­دست آمد، وضعیت شاخص LT₅₀برای رقم بهاره کویر بدون تغییر معنی‌دار قریب به 2- درجه سانتیگراد طی دوره تیمارهای انطباق با سرما در اتاق سرد باقی ماند، اما در ارقام دیگر این شاخص از روز دوم استقرار در اتاق سرد رو به افول نهاد (افزایش میزان تحمل) به­طوری­که مقادیر 3/18-، 3/8- و 3/6- درجه سانتیگراد برای ارقام نورستار، شهریار و الوند به ترتیب در 56، 28 و 28 روز اعمال تیمار بهاره‌سازی به ثبت رسید. نقش بهاره‌سازی در کنترل انباشت قندها در این پژوهش به­خوبی نمود یافت، به­گونه­ای­که روند انباشت فروکتان در طوقه ارقام، هماهنگ با روند تکمیل بهاره‌سازیو افزایش تحمل به سرما بود و با توسعه نیاز بهاره‌سازی و افزایش تحمل انجماد، میزان انباشت فروکتان نیز افزایش یافت. با توجه به طول دوره بهاره‌سازی بیشترین انباشت در رقم نورستار محقق گردید که قریب به چهار برابر بیش از میزان تجمع آن در اوج انباشت این قند در رقم کویر بود. این موضوع از همبستگی بالای انباشت این ترکیب با بیان مقاومت به سرما و تحمل به سرما در ارقام حکایت دارد. وضعیت انباشت و تحلیل در محتوای قند فروکتوز نیز بیان­گر وضعیتی مشابه با قند فروکتان در شرایط مزرعه بود. انباشت ساکارز در مزرعه در ارقام زمستانه و بینابین همسو با تکمیل نیاز بهاره‌سازی افزایش یافت که در رقم زمستانه نورستار این وضعیت پس از تکمیل نیاز بهاره‌سازی رو به افول نهاد اما در ارقام شهریار و الوند با شروع مرحله زایشی، این قند رو به فزونی نهاد. در همه ارقام گلوکز پس از تکمیل نیاز بهاره‌سازی در مزرعه از روندی صعودی تبعیت نمود. ساساکی و همکاران (1996) گزارش دادند که با اعمال تیمار سرما طی سه روز، بر میزان ساکارز، فروکتوز و گلوکز به ترتیب دو، سه و شش برابر افزوده می­شود، با گذشت یک هفته از اعمال تیمار سرما، میزان گلوکز و فروکتوز به سطح پایداری می­رسد و با تداوم اعمال تیمار از روز دهم میزان ساکارز رو به کاستی می­نهد. در پژوهش ایشان، به وجود همبستگی مثبت و معنی‌داری بین میزان کل کربوهیدرات‌ها مشتمل بر گلوکز، فروکتوز و ساکارز با درجه تحمل به انجماد اشاره شده­است. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که ارقام حساس و متحمل به سرما ترکیبات محافظت کننده مشابهی طی دوره خوگیری به سرما در بافت‌های خود انباشت می‌کنند و تفاوت این دو گروه در این زمینه به میزان و مدت زمان انباشت این ترکیبات باز می­گردد به طوری­که شدت و مدت زمان انباشت این ترکیبات در ارقام متحمل به دلیل تأثیر دوره­های متفاوت نیاز بهاره‌سازی طولانی­تر است. نتایج این پژوهش در تأیید فرضیه­ای است که اذعان می­دارد بهاره‌سازی و راه‌های خوگیری به سرما دو فرایند همبسته و همسو در غلات هستند و تأخیر در نمو زایشی تا سرآغاز بهار رویدادی حیاتی است که زمینه انطباق مناسب با دمای پایین را طی فصل سرما برای این گروه از گیاهان فراهم می­آورد.

ارزیابی تغییرات محتوای پرولین

با انجام مقایسه میانگین محتوای پرولین ارقام در شرایط مزرعه محرز گردیدرقم نورستار با 6/12 مایکرومول در گرم برگ تازه از بیشترین میزان محتوای پرولین بهره می­برد آنگاه رقم شهریار با 10 مایکرومول در گرم برگ تازه در جایگاه دوم قرار داشت، الوند با هشت مایکرومول در گرم برگ تازه در مرتبه بعدی مستقر بود و کویر با 6/5 مایکرومول در گرم برگ تازه از جایگاه آخر برخوردار بود. مقایسه میانگین روند تغییرات محتوای پرولین ارقام در شرایط مزرعه نیز حکایت از برتری محتوای پرولین به ترتیب در ارقام زمستانه، بینابین و بهاره داشت. روند تغییرات محتوای پرولین در تمامی ارقام در طول پاییز و زمستان از رویه­ای مشابه تبعیت نمود به­طوری­که بیشترین میزان تجمع پرولین در کلیه ارقام در ماه نخست زمستان محقق گردید که به ترتیب معادل 36، 5/26، 22 و 7/14 مایکرومول در گرم برگ تازه در ارقام نورستار، شهریار، الوند و کویر بود. مقایسه میانگین محتوای پرولین ارقام به روش دانکن در دو شرایط محیط کنترل­شده نرمال و اتاق سرد از وجود تفاوتی بسیار معنی‌دار در بین  دو محیط حکایت داشت به­طوری­که میانگین تجمع پرولین ارقام در شرایط اتاق سرد حدود شش برابر بیشتر از متوسط آن در شرایط نرمال بود. مقایسه میانگین محتوای پرولین تجمع یافته در ارقام به روش دانکن در شرایط اتاق سرد از وجود وضعیتی مشابه با شرایط مزرعه حکایت داشت به­طوری­که وجود تفاوت معنی‌دار بین همگی ارقام خودنمایی می‌کرد و جایگاه ارقام از مرتبه برتر به بدتر به ترتیب عبارت بود از نورستار، شهریار، الوند و کویر درحالی­که در شرایط نرمال همه ارقام از وضعیتی مشابه بهره می­بردند. روند تغییرات تجمع پرولین در ارقام در شرایط اتاق سرد با شروع اعمال تیمار خوگیری از وضعیتی صعودی برخوردار بود به­طوری­که این روند افزایشی در ارقام زمستانه و بینابین تا سه هفته و در رقم بهاره تا دو هفته اعمال تیمار خوگیری تداوم داشت به­طوری­که بیشینه تجمع پرولین در ارقام نورستار، شهریار، الوند و کویر به ترتیب معادل 21، 15، 10 و 7 مایکرومول در گرم برگ تازه بود و آنگاه از رویه­ای نزولی تبعیت نمود.

ارزیابی تغییرات تجمع پراکسیدهیدروژن:

ارزیابی وضعیت تجمع پراکسیدهیدروژن ارقام در شرایط مزرعه نشان از فزونی مقادیر آن به ترتیب در ارقام بهاره و بینابین بود به­طوری­که با بررسی مقایسه میانگین ارقام در شرایط مزرعه، بیشترین میزان تجمع پراکسیدهیدروژن در رقم بهاره کویر (4/40 مایکرومول در گرم برگ تازه) از بیشترین میزان برخوردار بود و آنگاه در مرتبه بعدی رقم بینابین الوند (6/31 مایکرومول در گرم برگ تازه) قرار داشت و ارقام زمستانه شهریار و نورستار به ترتیب با مقادیر 6/23 و 6/16 مایکرومول در گرم برگ تازه در رتبه­های بعد قرار گرفتند. روند تغییرات محتوای پراکسیدهیدروژن در شرایط مزرعه از وضعیتی نسبتاً مشابه برخوردار بود، هرچند که در طول پاییز و زمستان وجود تفاوت معنی‌دار بین ارقام تداوم داشت با روند تجمعی در تمامی ارقام طی پاییز رویه­ای فزونی را دنبال کرد یه­طوری­که در اوایل زمستان به بیشترین میزان خود رسید، بیشترین میزان تجمع پراکسیدهیدروژن در رقم بهاره کویر در اوایل زمستان (7/53 مایکرومول در گرم برگ تازه) رقم خورد و در همین موعد زمانی ارقام الوند، شهریار و نورستار به ترتیب با مقادیر 39، 29 و 22 مایکرومول در گرم برگ تازه در مرتبه­های بعدی قرار داشتند. با گسترش زمستان از مقادیر پراکسیدهیدروژن تجمعی در برگ ارقام نیز کاسته شد. در شرایط محیط کنترل شده تفاوتی ناچیز اما معنی‌دار بین میانگین محتوای پراکسیدهیدروژن ارقام در شرایط نرمال و اتاق سرد وجود داشت (9/8 مایکرومول در گرم برگ تازه در شرایط اتاق سرد در مقایسه با 8/7 مایکرومول در گرم برگ تازه در شرایط نرمال). در شرایط اتاق سرد، مقایسه میانگین تجمع پراکسیدهیدروژن به روش دانکن در ارقام از وجود تفاوت معنی‌دار بین ارقام بهاره، بینابین و زمستانه حکایت داشت، بیشترین میزان تجمع مربوط به رقم کویر (2/14 مایکرومول در گرم برگ تازه) بود در مرتبه بعد رقم الوند (9/8 مایکرومول در گرم برگ تازه) قرار داشت بین محتوای پراکسیدهیدروژن ارقام زمستانه نورستار و شهریار تفاوت معنی‌دار وجود نداشت. روند تغییرات میزان پراکسیدهیدروژن تجمعی در برگ ارقام متأثر از تیمار خوگیری به سرما در اتاق سرد حکایت از وجود روندی فزاینده تزایدی در رقم بهاره کویر طی دو هفته نخست اعمال تیمار بود و و پس از آن از شرایط نسبتاً پایدار برخوردار بود، در خصوص رقم بینابین الوند طی دو روز نخست اعمال تیمار، این روند از وضعیتی صعودی برخوردار بود و آنگاه کم و بیش ثابت ماند. در رقم شهریار نیز ابتدا طی دو روز نخست با کمی افزایش مواجه شد آنگاه از ثباتی نسبی تا سه هفته اعمال تیمار خوگیری به سرما برخوردار بود و سپس رو به افول نهاد. محتوای پراکسیدهیدروژن طی دو هفته تحت اعمال تیمار سرما بر رقم زمستانه نورستار نسبتاً ثابت بود سپس از هفته دوم رو به افول نهاد. 

ارزیابی تغییرات تجمع مالون­دی­آلدهاید:

مقایسه میانگین محتوای مالون­دی­آلدهاید تجمع یافته در ارقام در شرایط مزرعه طی پاییز و زمستان گویای آن بود که تجمع مالون­دی­آلدهاید در رقم بهاره دو برابر بیشتر از رقم بینابین و حدود 7-4 برابر بیشتر از ارقام زمستانه بود. بیشترین میزان تجمع در رقم بهاره کویر (5/37 نانومول در گرم برگ تازه) در رقم بعدی رقم الوند با 8/19 نانومول در گرم برگ تازه قرار داشت، ارقام شهریار و نورستار نیز به ترتیب با 10 و 5 نانومول در گرم برگ تازه در مرتبه­های بعدی قرار داشتند. روند تغییرات محتوای مالون­دی­آلدهاید طی فصل‌های پاییز و زمستان در رقم زمستانه نورستار در کمترین میزان قرار داشت و از رویه­ای نسبتاً ثابت برخوردار بود، رقم شهریار نیز کم و بیش از وضعیتی مشابه با نورستار در این مدت پیروی نمود، در رقم بینابین الوند روندی افزایشی نه چندان شدید اما قابل ملاحظه تا اوایل زمستان ملاحظه گردید و آنگاه به تدریج این تجمع روند رو به کاهشی نشان داد اما در رقم بهاره کویر این روند طی پاییز تا اوایل زمستان از رویه‌ای صعودی با سرعت فزاینده برخوردار بود و آنگاه رو به افول نهاد. مقایسه میانگین مقادیر تجمع ماون­دی­آلدهاید به روش دانکن در دو محیط نرمال و اتاق سرد از وجود تفاوتی نه چندان زیاد اما معنی‌دار بین دو محیط حکایت داشت بهطوری­که متوسط مقادیر در اتاق سرد (2/2 نانومول در گرم برگ تازه) در جایگاه برتر و این محتوی در شرایط نرمال (3/1 نانومول در گرم برگ تازه) در مرتبه پایین­تر قرار داشت.

بررسی بیان ژن‌هایبهاره‌سازی:

پاسخ فیزیولولوژیک و مولکولی بهاره‌سازی در بذرهای جو (Hordeum vulgare L.) و گندم (Triticumaestivum L.) در دو فاز، طی آزمایشی دیگر مورد بررسی قرار گرفت، به طوری­که از یک سو بذرهای مرطوب به منظور بهاره‌سازی، در محیطی تاریک در معرض سرما قرار گرفتند و از دیگر سوی تسریع نمو و ورود به فاز زایشی به عنوان فرایندی متأخر نسبت به بهاره‌سازی مورد ارزیابی قرار گرفت. بیان ژن VERNALIZATION1(HvVRN1) در مریستم انتهایی و برگ‌های در حال رشد به­تدریج طی دوره تکمیل بهاره‌سازی در گیاهچه‌‌ها افزایش یافت. این افزایش بیان ژن در شرایط تاریکومستقلازبیانژنVERNALIZATION2(HvVRN2) صورت گرفت که همسو با فرضیه افزایش بیان ژن HvVRN1 در تداوم سرما و مستقل از مسیرهای پاسخ گلدهی به طول روز بود. بیان ژن HvVRN1 پس از دوره تکمیل بهاره‌سازی نیز در مریستم انتهایی ساقه و برگ‌ها همچنان تداوم یافت که این امر با تسریع القای گل­دهی و  کاهش بیان ژن HvVRN2 در برگ‌ها همراه بود. افزایش سطح بیان ژنHvVRN1 در گیاهان بهاره‌سازی‌شده با طول دوره بهاره‌سازی بذرها همبستگی داشت. طول روز تأثیری بر سطح بیان ژن HvVRN1 در مریستم انتهایی و همچنین در برگ‌ها نداشت، بااینحال در برگ گیاهانی که تیمار اشباع بهاره‌سازی بر بذرشان اعمال شده بود بیان ژن HvVRN1 در طول روزهای بلند افزون‌تر بود. ژن HvFT1 در طول روز بلند تنها در برگ گیاهان بیان گردید که ممکن است این امر مرتبط با افزایش بیان ژن HvVRN1 باشد. افزایش بیان ناشی از روزهای بلند در ژن HvVRN1  ضرورتی جهت القای فاز زایشی در گیاهان نداشت هر چند که ممکن است به عنوان عاملی تاثیرگذار در مراحل نموی متأخر در فاز زایشی موثر باشد(Sasani et al., 2009). این پژوهش در همین راستا به پاسخی مشابه در مورد گندم نان (Triticum aestivum L.) نیز دست یافت. به طور کلی نتایج این پژوهش در تأیید فرضیه‌ایست که بیان می‌دارد القای بیان ژن VRN1 در سرمای زمستان، منجر به گلدهی غلات نیازمند به بهاره‌سازی در فصل بهار می‌گردد.

نتیجه‌گیری کلی:

تحمل به سرما در گندم روند تجمعی است که حداکثر مقدار آن در زمان انتقال از مرحله رویشی به زایشی حاصل می‌شود و بعد از آغاز مرحله زایشی تحمل گیاه کاهش می‌یابد، بنابر این شناسنایی عوامل موثر در کنترل مرحله رویشی به زایشی مهم است. تحقیقات انجام شده در این مقاله پیچیدگی اثرات متقابل ژنوتیپ، محیط و مرحله نموی گندم، مسیرهای متابولیک و پروسه‌های ملکولی سازگاری به سرما را مورد تاکید قرار می‌دهد. شناساییپروتئین‌های مرتبط با سرعت آغازین  عادت‌دهی به سرما که با شیب تند در رقم بسیار متحمل در مقایسه با ارقام حساس بیان می‌شوند و نیز شناساییپروتئین‌هایی که در مرحله زایشی بیان میشوند کمک میکنند تا به شناساییژن‌های درگیر در تحمل به سرما دست یابیم. یافته‌های ما بیانگر آن است که مدت زمان بیان پروتئین‌های سرما القایی در ژنوتیپهای زمستانه با ژن‌های نموی نظیر بهاره‌سازی و دیگر ژن‌های موثر در انتقال از مرحله رویشی به زایشی کنترل می‌شوند.

گروه پروتئین‌های عمده شناسایی شده در تحقیقات ما پروتئین‌های سرما القایی، ضد یخ، آنتی اکسیدان‌های دفاعی، فتوسنتز، متابولیسم،پروتئین‌های موثر در رونویسی و انتقال و حمل یونی بودند. شایان ذکر است که در مراحل اولیه عادت‌دهی به سرما در شرایط مزرعه در هر دو اقلیم سرد و معتدل سرد تعدادی از پروتئین‌ها از جمله پروتئین‌های putative AP2 domain transcription factor، Cytochrome P450-like و  glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase تغییرات افزایشی محسوسی را نشان دادند و در زمان تکمیل بهاره‌سازی که گیاهان در مزرعه به حداکثر میزان تحمل به سرما رسیدند افزایش بیان چاپرون‌های شوک حرارتی و زیر واحد بتا آنزیم روبیسکو که نقش آنها پیش تر در تنش‌های محیطی نمایان شدهُبیشتر بود. با انتقال از مرحله رویشی به زایشی بیان تعداد زیادی از پروتئین‌ها از جمله  transporter، cell-autonomous heat shock cognate protein 70،CDK activating kinase و ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase activaseکاهش نشان دادند.

سطح بیان و نیز تعداد پروتئین‌های بیان شده درگیاهان رشد یافته در شرایط مزرعه که دوره‌های عادت‌دهی به سرما دردماهای زیر صفر را تجربه میکنند نسبت به گیاهان عادت یافته به سرما در دمای پایین ولی بالای صفر (شرایط کنترل شده) بسیار بیشتر بوده و از مقاومت بالایی بر خوردار هستند. با توجه به دستاوردهای این تحقیق می‌توان چنین استنباط نمود که صفات نموی از طریق تأثیر بر طول دوره رویش، مدت زمان بیان تحمل به سرما، انباشت اسمولیت‌ها و متابولیت‌های محافظُ گیاه در برابر سرما را تحت تأثیر قرار داده و زمینه افزایش تحمل در برابر سرما را در گیاه فراهم می­آورند. محدوده تکمیل نیاز بهاره‌سازی به عنوان نقطه عطفی در بیان تحمل به سرما، و انباشت متابولیت‌های حفاظت­کننده گیاه در برابر سرما مطرح است که پس از این محدوده کاهشی قابل ملاحظه در بیان تحمل به سرمای رقم می­خورد. سطح انباشت متابولیت‌های بیوشیمیایی محافظت کننده گیاه نیز در برابر تنش در شرایط مزرعه بیشتر از شرایط کنترل شده بود که نقش دماهایعادت‌دهی به زیر صفر را در افزایش تحمل نشان می‌دهند.